NMT系统使用经验

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系统运行准备

开关机注意事项

  • 系统开机前要注意把稳压电源接入插线板的总开关打开,然后再逐一打开系统相关部件电源。
  • 冬天由于气温低,空气干燥,开机前要打开空调和加湿器,将室内温度和湿度调节到合适范围(室温22℃-25℃,湿度50%-60%),同时操作者要穿上防静电服。
  • 关机时要注意将各部件旋钮及开关放到正确的位置,方便下一次使用,还需要注意将三维运动位移平台的螺杆位置调节到中间,这样才能增加其使用寿命。最后不要忘记关闭总电源。

制备传感器

传感器开口与型号

  • 传感器开口(尖端直径)很重要,传感器的尖端直径决定了实验的空间分辨率及传感器的输入电阻,同时传感器尖端的形状很大程度上决定着吸附LIX的能力。
  • 目前,非损伤微测实验常用的传感器开口大小为1-2μm、4-5μm、8-10μm。

传感器型号:
XY-CGQ-01(组织样品专用4-5 μm)
XY-CGQ-02(细胞样品专用1-2 μm)
XY-CGQ01(组织样品专用8-10 μm)

LIX灌注注意事项

LIX灌注长度

  • LIX的长度随传感器种类不同而不同,一般除K+、Cl-和NO3-传感器外,LIX长度应在40-50μm,K+传感器180μm,Cl-和NO3-传感器80μm;
  • 灌充长度影响尖端的电阻,灌充过长的话电阻增大,传感器稳定较慢。而灌充过短的话容易造成LIX泄漏。
  • 离子选择性微传感器灌充液成分、离子交换剂型号、灌充长度一览表
离子\项目 灌充液成分 离子交换剂 LIX灌充长度
H+ 15 mM NaCl +40mM KH2PO4(pH 7.0) XY-SJ-H 40-50μm
Ca2+ 100 mM CaCl2 XY-SJ-Ca 40-50μm
K+ 100 mM KCl XY-SJ-K 180μm
Na+ 250 mM NaCl XY-SJ-Na 40-50μm
Cl- 100 mM KCl XY-SJ-Cl 80μm
NH4+ 100 mM NH4Cl XY-SJ-NH4 40-50μm
NO3- 10 mM KNO3 XY-SJ-NO3 80μm
Cd2+ 10mM Cd(NO3)2+0.1mM KCl XY-SJ-Cd 40-50μm
Mg2+ 500mM MgCl2 XY-SJ-Mg 40-50μm

传感器校正

什么是校正及校正的目的

  • NMT测试中的传感器校正指的是:将传感器放入已知离子浓度(不同浓度,2个或3个)的溶液中读取电压值,以Nernst方程为基础,建立浓度和电压的关系。
  • 校正的目的主要有两个:
  1. 建立浓度和电压的线性关系,用于流速的计算。同时确定传感器是否正常工作。
  2. 保证测量结果的准确性。所以需要校正时必须校正。
  • 正常情况下传感器在一次测试中最少需要校正2次,即测试开始前一次,结束时一次,有些特殊的传感器,例如Cl-传感器,为了获得准确的数据,需要多次校正,这属于正常的校正。
  • 校正和传感器漂移有关,漂移是一个持续的过程,一般来讲,当1价离子电位变化10mV以上,2价离子电位变化5mV以上时,需要再次校正。
  • 有的数据在校正前后算得的流速差别很大,造成的原因是因为重新校正后,会得到新的斜率值和截距值,如果没有用新的斜率值和截距值计算数据的话,校正前后算出来的结果就会差的比较大,所以要特别注意。但是有时候,流速差别较大可能往往表现的正是活体样品真实的生理反应,所以样品的选择上要多注意。

校正时的注意事项

  • 传感器不要碰底部,但最好深入液面较深处;参比电极和离子传感器的距离要保持相对固定,不要忽远忽近;在更换校正液之前冲洗参比电极。
  • H+需要将pH值换算成mM后再输入。
  • 以下是常用离子/分子不同浓度校正液相对应的电位值的参考值,不同系统下会有一定偏差,但如果没有特殊情况,电位值应该在这个范围之内。

下表为校正液浓度为0.1mM时,各离子传感器电位的经验值。

离子 电位值
Na+ -90 mV— -50 mV
K+ -100 mV— -70 mV
NH4+ -80 mV— -40 mV
Ca2+ -20 mV— +10 mV
Mg2+ -20 mV— +10 mV
Cd2+ +150 mV— +200 mV
NO3- +280 mV— +350 mV
Cl- +200 mV— +250 mV
H+(pH6.0) +150 mV— +200 mV

配制校正液

  • 配制校正液时,最好采用先配制好较高浓度的母液,然后稀释的方法配制,不要直接溶解固体,因为校正液中的离子浓度一般较低(大多数是0.01mM~1mM),直接用固体配的话称量的量会很少,导致误差增大,校正时不能达到理想值。
  • 每种离子的校正液要有一高一低两种浓度,原则上是要将测试液中该离子的浓度包含在内,一般高低浓度相差10倍,比如测试液中Na+是0.9mM,校正液就可以是0.5mM和5mM。H+的话原理一样,调节高低两种pH即可。
  • 校正液中除了待测离子外,还应该有测试液中同浓度的其他离子,pH最好也和测试液一致,如果要测定多种离子,可以配制成同一瓶校正液,但校正液中的待测离子浓度要相应改变。
  • 由于不同LIX的选择性不同,所以配制校正液时的离子浓度也是有要求的:
  1. H+:pH4-pH9之间。
  2. Na+:10mM—0.5mM,而且溶液中K+浓度不要高于Na+
  3. K+:10mM—0.05mM,且溶液中Na+浓度不要高于K+
  4. Ca2+:10mM—0.05mM,且溶液中最好没有Cd2+或者浓度低10倍以上。
  5. Mg2+:10mM—0.1mM,且溶液中最好没有Cd2+和Ca2+或者浓度低10倍以上。
  6. Cd2+:1mM—0.005mM,别的离子基本没什么影响。
  7. NH4+:10mM—0.05mM,电位可能不是很稳定,可以选用大开口传感器,如果测试中电位变化过大可以多校正或更换LIX。
  8. NO3-:10mM—0.05mM,Cl-浓度不要太高。
  9. Cl-:10mM—0.5mM,溶液中不能有其他阴离子,可能需要多次校正。
  • 调节校正液的pH需注意,不能用含有待测离子的酸或碱调节,如测定Na+时调节pH值不能用NaOH,否则就使溶液中的Na+含量增加,可用较少量的KOH调节,最好用氯化胆碱或Tris。

参比电极的使用及注意事项

  • 非损伤微测系统中的参比电极主要有两个作用:
  1. 和传感器、测试液、前置放大器一起构成电路回路,
  2. 提供一个参考电位。
  • 使用时要注意以下几点:
  1. 灌充溶液时,要将塑料管连接部分从后端拧下来,从后端用传感器灌充液的那种细的注射头灌充溶液,参比内液不要灌充太多,浸没过氯化银丝部分1cm即可。
  2. 新灌充3M KCl后,需要让氯化银丝在参比内液中浸泡24小时以上,这样电位稳定得快一些。
  3. 灌充溶液时,注意保护好内部银丝尖端的氯化银部分,不要私自用砂纸磨或者剪断。
  4. 每次使用完毕后,将参比电极浸泡在3MKCL溶液中(即收纳管内),不要暴露在空气中,如果长时间不使用,需要将塑料管中的溶液全部吸出,再用蒸馏水润洗几遍,晾干后保存。
  • 当测试过程中出现电位不正常时,可以首先更换传感器(或LIX),排除传感器问题后,最有可能是参比电极的问题,大概有以下几种情况:
  1. 静态电位显示+-5.000V:检查参比电极接口是否插入前置放大器接口中,参比电极是否放入测试液中,参比电极中的溶液是否没过银丝尖端。
  2. 校正值在正常范围内,但是比起经验值偏大或偏小(比如低于-150mV,高于500mV等),首先确定测试液和传感器灌充液浓度是否正确,之后检查参比电极中的灌充液浓度是否正常,可以重新配制后重新灌充;如果还不行的话,可以更换参比电极的塑料管,新的参比电极附带一个备用的。
  3. 当电位变化很快时,除了传感器的电位漂移外,还有可能是参比电极漏液造成的,可以更换塑料管试试。
  • 参比电极位置应尽量远离样品;最好深入液面5mm;测试时尽量将参比电极相对与样品的位置固定。

传感器校正常见问题解答(请点击)

样品固定及观察

  • 显微镜放大倍数选择原则:

一般根据样品大小不同,使用不同放大倍数。组织样品较大,则可以根据实际情况,选择较低倍数物镜测定;细胞样品相对较小,为了测量准确,则必须使用较高倍数物镜。

传感器定位

  • 测试时需保证传感器和样品距离的一致性
测试时传感器与样品的距离直接决定着测试信号的大小,尤其是信号大的样品,传感器距离样品的距离稍微不同,测出来的信号大小也就不一样,因而要保证每次测试时传感器与样品距离的一致性。
  • 保证传感器与样品距离固定的方法
NMT可以用计算机键盘控制传感器在x、y、z方向进行定距离的运动,运动距离大小可以手动输入确定,显示器也用此方法精确测量了所视范围的长和宽,测试工程师可以每次测试时先在显示器范围内找到样品的固定位置,让传感器稍稍贴住样品,然后朝所需方向移动传感器,从而达到精确定位的目的。
精确定位程度和显示的放大倍数有关,放大倍数越大越精确,目前可以达到40倍;还与传感器移动的最小距离有关,现在传感器移动最小可以精确到0.5um。

实际测量

分子传感器实际测试经验(请点击)

测定时的注意事项

  1. 请注意当一天中第一次测定时,建议将微传感器放入空白测试中进行5分钟的流速测定,观察测定数值,以确保测定数值应在基线附近。
  2. 可能在初始测定时会遇到增强的干扰信号和瞬时人工信号。如果传感器是好的,运行几分钟,它就会稳定下来。如果半个小时后还未稳定,请更换一支新传感器。
  3. 如果测试中出现电位在测试液中严重漂移的情况(一价离子电位变化在±10mv以上;二价离子电位变化在±5mv以上),需要重新进行传感器校正,并在测试记录表上进行相应的记录。
  4. 测试开始时接近样品出现较大波动,此时可以依次更换另一个测试点、更换测试液;波动仍然存在,更换空白测试液测定;若没有波动,说明可能是样品问题,更换新样品。
  5. 如果一开始测定时没问题,测试过程中出现波动,大多数是样品或溶液本身造成的,可按上述步骤检测和排除问题。
  6. 测试时需要瞬时处理时需要注意,要标记为“add NaCl”,不要标记成“+NaCl”,因为在用EXCEL打开时,单元格中的内容不能显示“+NaCl”,会报错,而“add NaCl”可以显示,不会报错。
  7. 离子是外流还是内流,以原始数据中的dV判断最为准确。
  • 极谱分子传感器测试
  1. 对于极谱分子传感器而言,“Raw A/D”模式下显示的数值实际是电流值,单位是“nA”。

原点电位问题

  • 测试的时候,测的是K+,发现K+有个比较大的吸收,但背景电位却是上升的,会出现这种情况,可能是样品在测试前处在一个K+含量比较高的环境下,在测试时又没有在测试液中平衡一定时间,所以导致样品周围K+含量较测试液高,而样品对溶液中的K+是吸收趋势,最后才导致这种结果。
  • 也可能是样品大部分的区域对K+都是外排趋势,导致样品周围整体电位升高,但是测得点确是吸收趋势,也可能导致这种结果。
  • 如果传感器远离样品时电位恢复,建议先用蒸馏水多冲洗一下样品,平衡时间加长(≈30min)并且更换几次测试液。
  • 如果还不行的话,就看看每个样品测试时电位是否变化较大,保证每个样品电位基本一致,也可以继续测试。
  • 测试中加入某些药品,尤其是有机物,会对LIX有较大影响,电位会变化很多,需要多加注意!
  • 测试前最好做一个空白对照加入药品的实验,如果电位上没有太大变化,可以直接瞬时处理;如果变化较大的话,根据测试需要,建议采取预处理的办法。

注意小键盘按键

  • 系统操作时方向键上下左右、home/end是三维三个方向的操作键。如果小键盘的numlock灯亮起时,小键盘的数字键就是数字键,输入数字时可以使用;如果numlock灯灭了的状态,4、6(左右)、2、8(上下)、7(home)、1(end)就等于是三维操作运动控制的键盘方向键。
  • 在操作时注意如果numlock灯熄灭时别误操作数字键。

实际测量常见问题解答(请点击)

其他系统操作

银丝氯化

  • 用来氯化的电解液的浓度不能太高,用0.1M HCl/KCl即可。
  • 氯化的时间适中,30s即可,时间太短氯化效果不好,太长可能会将银丝弄断。
  • 电池电力不足会导致银丝氯化效果不好。

分子传感器测试常见问题解答(请点击)

文献资料

非损伤微测技术文章撰写参考资料

文件:非损伤微测技术文章撰写参考资料 V5.0.doc

文章撰写资料试剂耗材型号发表的文献

文件:C2015-001-Overexpression of bacterial c-glutamylcysteine synthetase.pdf

传感器工作原理文献

文献里介绍了Ca2+传感器结构、组成、LIX如何工作,流速如何测定等等基本问题

媒体文件:Construction,_Theory_and_Practical_Considerations_for_using_Self-Referencing_of_Ca2+-Selective_Microelectrodes_for_Monitoring_Extracellular_Ca2+_Gradients.pdf ‎